QPCR

實(shí)驗(yàn)原理

QPCR基于傳統(tǒng)的聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)，通過(guò)逐漸擴(kuò)增目標(biāo)DNA或cDNA的數(shù)量使其可檢測(cè)。與傳統(tǒng)PCR不同的是，qPCR在擴(kuò)增過(guò)程中同時(shí)進(jìn)行熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。

qPCR的原理基于熒光探針（例如TaqMan探針或SYBR Green I染料）。這些探針通過(guò)與目標(biāo)序列的特異性結(jié)合，在PCR過(guò)程中釋放熒光信號(hào)。

SYBR Green I：該染料能與DNA雙鏈結(jié)合，當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生新的雙鏈DNA時(shí)，SYBR Green I與其結(jié)合并發(fā)出熒光信號(hào)。

TaqMan探針：該探針由引物和熒光探針組成，熒光探針含有一個(gè)熒光染料和一個(gè)熒光猝滅劑。在PCR擴(kuò)增過(guò)程中，熒光探針通過(guò)引物特異性結(jié)合到目標(biāo)序列上，并且Taqpolymerase酵素的核酸酶活性會(huì)切除掉熒光探針上的猝滅劑，導(dǎo)致熒光染料釋放出信號(hào)。

通過(guò)檢測(cè)PCR擴(kuò)增過(guò)程中的熒光信號(hào)強(qiáng)度，可以確定目標(biāo)序列相對(duì)起始數(shù)量。通常通過(guò)計(jì)算Ct值（熒光信號(hào)達(dá)到閾值的循環(huán)數(shù)）來(lái)衡量目標(biāo)序列的豐度。通過(guò)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)或使用ΔCt方法，可以將待測(cè)樣本中目標(biāo)序列的相對(duì)豐度與參考基因或?qū)φ战M進(jìn)行比較。

實(shí)驗(yàn)步驟

提取核酸、反轉(zhuǎn)錄（僅適用于RNA樣本）、預(yù)處理、設(shè)計(jì)引物和探針、準(zhǔn)備反應(yīng)體系、執(zhí)行PCR循環(huán)、數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用途徑

1.定量分析未知模板；2.單個(gè)或多個(gè)基因表達(dá)譜分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果