VisuGait 動(dòng)物步態(tài)分析系統(tǒng)是通過腳印光亮折射技術(shù)，采用高速攝像機(jī)采集移動(dòng)中的大小鼠行走過程中的足印信息，然后利用上海欣軟自主開發(fā)的足印步態(tài)分析系統(tǒng)自動(dòng)識(shí)別分析小鼠的步態(tài)指標(biāo)，以評(píng)價(jià)小鼠的運(yùn)動(dòng)和空間學(xué)習(xí)能力。評(píng)價(jià)指標(biāo)包括：觸地面積、擺動(dòng)速度、擺動(dòng)時(shí)長(zhǎng)、制動(dòng)時(shí)長(zhǎng)、步行周期、前后肢步寬、正常步序比等等，以此客觀評(píng)價(jià)PD模型的步態(tài)改變。

動(dòng)物步態(tài)分析系統(tǒng)可用于評(píng)價(jià)神經(jīng)創(chuàng)傷、神經(jīng)性、神經(jīng)疾病、以及疼痛癥狀群的動(dòng)物模型。該系統(tǒng)應(yīng)用范圍包括：脊索損傷、神經(jīng)性疼痛、關(guān)節(jié)炎、中風(fēng)、帕金森病、運(yùn)動(dòng)失調(diào)、腦損傷、外周神經(jīng)損傷等疾病的研究。通過步態(tài)分析，了解神經(jīng)源性疾病發(fā)展過程、評(píng)價(jià)治療方法的效果和篩選治療藥物。

帕金森氏癥導(dǎo)致肢體動(dòng)作僵硬和協(xié)調(diào)性降低。步態(tài)分析系統(tǒng)通過測(cè)量動(dòng)物模型中的腳間距離、擺動(dòng)時(shí)相、支撐方式和正常步序比等參數(shù)評(píng)估運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)性。

摘要

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是世界范圍內(nèi)第二大神經(jīng)退行性疾病，由于目前并未開發(fā)出前期的診斷方法，在病程中后期已無法治，臨床上多采用保守治療，藥物緩解癥狀和手術(shù)輔助治療。目前常用左旋多的巴來彌補(bǔ)多巴胺能神經(jīng)元缺失所引起的多巴胺分泌不足，但是這種藥物緩解PD癥狀依賴于多巴脫羧酶的催化而發(fā)揮藥效，隨著晚期PD病人的神經(jīng)元缺失，這種酶也將減少，只能在早期發(fā)揮比較明顯的作用，加大藥量的同時(shí)也將產(chǎn)生更加明顯的副作用，除了增加肝腎負(fù)擔(dān)以外，還會(huì)引起不自主運(yùn)動(dòng)和精神錯(cuò)亂等癥狀，因此，繼續(xù)探索PD的發(fā)病機(jī)制，尋找更加合適的藥物靶標(biāo)挽救神經(jīng)元的缺失并探索合適的藥物仍然是探索的方向。

研究背景

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一種神經(jīng)退行性疾病（Neurodegenerative disease），具有不斷演變的復(fù)雜性。是以黑質(zhì)-紋狀體多巴胺能神經(jīng)元的嚴(yán)重缺失以及路易小體和神經(jīng)突觸內(nèi)含物的積累和擴(kuò)散為主要病理標(biāo)志的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。帕金森病被認(rèn)為是繼阿爾茨海默病之后第二大的神經(jīng)退行性疾病，成為世界上患者增長(zhǎng)速度最快的神經(jīng)退行性疾病，自1990年到2015年的25年間，病患人數(shù)增長(zhǎng)已一倍，達(dá)到600多萬。隨著全球老齡化愈加嚴(yán)重，預(yù)計(jì)到2040年，病患人數(shù)將再增長(zhǎng)一倍。PD的發(fā)病機(jī)制和病因至今尚未明確， 并沒有任何一種獨(dú)立學(xué)說能夠闡明其分子致病機(jī)制，已經(jīng)證明的分子機(jī)制包括氧化應(yīng)激下活性氧簇（Reactive oxygen species，ROS）的過量產(chǎn)生、α-突觸核蛋白（α-synuclein）沉積、多巴胺（DA）合成減少或線粒體功能障礙等。主要影響運(yùn)動(dòng)神經(jīng)系統(tǒng)，臨床癥狀主要包括：1.運(yùn)動(dòng)癥狀：靜止性震顫、僵硬、步態(tài)異常等。2.睡眠障礙、認(rèn)知障礙和抑郁等。

為此，探究 PD 致病機(jī)制，闡明神經(jīng)元缺失的分子機(jī)理或許是突破現(xiàn)有PD治療策略的重要方向。

實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)材料：

1. A53T轉(zhuǎn)基因小鼠或基因敲除小鼠（品系均為C57BL/6J）。

2. 10%酒精用于擦拭步態(tài)玻璃板。

注：75%酒精氣味刺激性大，頻繁使用將導(dǎo)致小鼠不愿通過跑道。

3. 衛(wèi)生紙。

4. 空籠盒。

行為學(xué)測(cè)試步驟包括：

（1）VisuGait 動(dòng)物步態(tài)分析系統(tǒng)軟件，該軟件從位于t臺(tái)跑道下方的攝像機(jī)接收信息，并檢測(cè)由于對(duì)跑道表面施加壓力(例如，通過放置爪子)而從跑道表面反射的光線。

（2）把老鼠放到t臺(tái)的一邊。

（3）通過簡(jiǎn)單的按鈕點(diǎn)擊，以電子方式啟動(dòng)系統(tǒng)。

（4）讓動(dòng)物走到跑道的另一邊。

模型建立與藥物處理：目前PD常用模型有神經(jīng)毒素模型和基因編輯模型，其中神經(jīng)毒素模型應(yīng)用更加廣泛。本課題兩種模型均有涉及，對(duì)PD模型A53T轉(zhuǎn)基因小鼠或基因敲除小鼠，使用小動(dòng)物麻醉的機(jī)對(duì)小鼠按推薦計(jì)量使用異氟的烷進(jìn)行麻醉后固定于腦立體定位儀上，通過顱骨的鉆在小鼠顱骨上鉆孔，將顯微注射針植入鉆孔側(cè)大腦紋狀體區(qū)域后，使用 6-OHDA（8 mg/kg）對(duì)敲除小鼠紋狀體注射，聯(lián)同使用治療藥物21天。

動(dòng)物生存環(huán)境：將雌雄小鼠分開飼養(yǎng)每籠4-5只，分籠可避免發(fā)情和交配引起的激素水平改變，影響行為學(xué)的測(cè)試。室溫控制在22-25℃，12-12小時(shí)光暗循環(huán)的安靜環(huán)境中。給予充足的食物和飲用水。

注：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生存環(huán)境一定要安靜， 驚恐狀態(tài)下的小鼠，行為異常，不能反映真實(shí)行為學(xué)指標(biāo)。每組小鼠最好不少于8只，以減少個(gè)體間差異，避免實(shí)驗(yàn)偶然性。選擇12-14周齡小鼠，神經(jīng)退行性疾病小鼠隨著年齡增加，神經(jīng)元缺失更加嚴(yán)重，年齡太大，在病程后期，小鼠無法直立行走，年齡太小，表型不明顯，觀測(cè)不到運(yùn)動(dòng)異常指標(biāo)。

行為學(xué)測(cè)試前準(zhǔn)備：

提前適應(yīng)環(huán)境：將小鼠提前兩天放入測(cè)試環(huán)境空間飼養(yǎng)（最好是將設(shè)備放在飼養(yǎng)環(huán)境測(cè)試），更換環(huán)境后，小鼠因?yàn)榭照{(diào)出風(fēng)口方向、光線照射位置、環(huán)境氣味等改變，而表現(xiàn)出焦慮情緒，而PD患者本身就存在非運(yùn)動(dòng)癥狀，環(huán)境可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

設(shè)備調(diào)試：步態(tài)利用的是腳印光亮折射技術(shù)，建議實(shí)驗(yàn)者提前一天在實(shí)驗(yàn)預(yù)計(jì)進(jìn)行的同一時(shí)間段調(diào)試設(shè)備。

注：白天和夜晚的采光不同，通道的光線明暗對(duì)腳印識(shí)別至關(guān)重要，最初光調(diào)試設(shè)備就可能要花費(fèi)幾個(gè)小時(shí)。其次是相機(jī)參數(shù)設(shè)置，在多數(shù)神經(jīng)退行性疾病模型中，需要分時(shí)間段進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試，進(jìn)入步態(tài)軟件設(shè)置標(biāo)尺需要用A4紙畫一個(gè)實(shí)體的標(biāo)尺，在課題進(jìn)行過程中，最好使用同一標(biāo)尺，也不要改變軟件中方框的大小，因?yàn)檐浖峭ㄟ^等比例計(jì)算擺動(dòng)距離、步長(zhǎng)、前后肢間距等長(zhǎng)度相關(guān)指數(shù)，只有在同一標(biāo)尺下，不同時(shí)間段的指標(biāo)才有比較的意義。

測(cè)試前訓(xùn)練：步態(tài)分析的測(cè)試前訓(xùn)練是必要的，將實(shí)驗(yàn)鼠放入步態(tài)跑道上，第一次上跑道可將同籠鼠一起放入跑道5-10分鐘，保持安靜環(huán)境下，不進(jìn)行測(cè)試，當(dāng)老鼠通過通道，它會(huì)記住有一個(gè)出口可以回到籠子里和同伴待在一起，這將會(huì)是老鼠真正通過通道的動(dòng)機(jī)。然后分別將實(shí)驗(yàn)小鼠放入跑道一端，將另一端用擋板封堵，在電腦前等待小鼠進(jìn)入錄像區(qū)域開始記錄。

注：測(cè)試開始時(shí)，實(shí)驗(yàn)小鼠并不能很好適應(yīng)環(huán)境，在驚恐狀態(tài)下不會(huì)馬上通過通道，切勿驅(qū)趕、恐嚇方式促使小鼠通過跑道，一只老鼠幾乎不會(huì)停留在玻璃板上超過20分鐘不動(dòng)，可能測(cè)試兩三百只才回出現(xiàn)一次。在陌生環(huán)境中食物引誘的方法也不可取。在一個(gè)新的環(huán)境中，老鼠甚至不愿意嘗試這種方法，因?yàn)檫@可能讓他們覺得會(huì)威脅到健康。老鼠是全球成功的物種之一，它們非常聰明，通常會(huì)避免嘗試任何新事物，除非是為了獲益而承擔(dān)風(fēng)險(xiǎn)。通過限制飼養(yǎng)糧食的量，每次通過通道后，通過獎(jiǎng)勵(lì)小食物顆粒來刺激動(dòng)物穿過人行道，也有研究者這樣操作。絕大多數(shù)(>95%)的小鼠在經(jīng)過1-2周的訓(xùn)練后（動(dòng)物被要求在每天12克的食物限制下每天跑2次），就能夠迅速地連續(xù)跑過步態(tài)設(shè)備的玻璃板。這可能是小鼠天生的探索天性所使然。特別注意介紹步態(tài)相關(guān)文獻(xiàn)中都強(qiáng)調(diào)了小鼠是在自愿狀態(tài)下通過通道，記錄真實(shí)的步態(tài)的。